纸基比色检测方法，便宜且快速检测新冠病毒及其变体
2022-09-03 09:55:00   来源：麦姆斯咨询   评论：0   点击：

一种利用DNA链置换反应和酶促扩增来识别病毒RNA并在折纸上实施的分析方案，可以快速比色检测具有单核苷酸特异性的新冠病毒（SARS-CoV-2）变异毒株。

据麦姆斯咨询报道，近日，清华大学李景虹教授、四川大学华西医院李为民院长和邓锐杰研究员及团队其他成员在Nature Biomedical Engineering上发表了一篇题为“A paper-based assay for the colorimetric detection of SARS-CoV-2 variants at single-nucleotide resolution”的论文，阐述了一种用于新冠病毒（SARS-CoV-2）核酸检测的纸基检测方法，该检测方法速度快（从样品输入到出结果只需30分钟）、便宜（单次检测花费不到1美元），结果肉眼可读。并且，该检测方法可以检测到每微升低至400拷贝的病毒RNA，并利用高度特异性的核酸相互作用来识别令人担忧的SARS-CoV-2变异毒株。

利用MARVE技术对SARS-CoV-2变异毒株的检测

为了建立这种灵敏、快速且简单的检测方法，李景虹教授及其团队成员采用了一种无需核酸扩增的方案。他们将这种检测技术命名为“MARVE（多路复用、无核酸扩增、单核苷酸分解的病毒进化）”，该检测技术用到酚红（一种常见的pH指示剂），随着pH值的降低酚红颜色会发生巨大变化（从红色变为黄色）。为了将pH值的变化与病毒RNA联系起来，研究人员巧妙地利用了Ag（银）离子，使其与基于DNA的探针和酶脲酶相互作用。

与许多金属阳离子一样，Ag(I)（一价银离子）与带负电荷的DNA强烈的相互作用，当暴露于DNA双螺旋中的胞嘧啶-胞嘧啶（C-C）错配时形成C-Ag-C复合物。同时，水解尿素释放弱碱氨的脲酶受到游离Ag(I)离子的强烈抑制。因此，为了检测病毒RNA，研究人员设计了DNA探针，使其与SARS-CoV-2序列结合时释放Ag(I)（下图a）。释放的Ag(I)转而抑制脲酶活性，形成致使pH值较低的环境条件，出现黄色读数。在没有病毒RNA存在时，探针保留Ag(I)，活性脲酶分解尿素产生氨，形成致使pH值较高的环境条件，出现红色读数。该反应可在溶液中或纸质基材上进行，通过智能手机分析，可提供肉眼容易识别的比色测试结果。

a、立足点交换DNA探针（TEprobe）选择性地与病毒RNA靶标相互作用，释放Ag(I)离子以抑制脲酶水解，创建产生黄色读数的低pH环境条件；b、将测定反应整合到折纸中

李景虹教授及其团队在实验中使用的立足点交换DNA探针是其特异性的核心。该探针由两条部分互补的链（Rec和Block）组成，它们最初相互杂交。探针复合物中的Rec链有一个单链区域（称为正向立足点），使其能够与病毒RNA结合。探针另一端有一个双链区域（反向立足点），其特征是与Ag(I) 结合的 C:C错配（上图a）。当目标病毒RNA与探针结合时，Block链被置换，导致反向立足点双链体的破坏，释放出Ag(I)。重要的是，正向和反向立足点的序列经过精心编程，因此只有与Rec链的识别区域完全互补的病毒RNA才能完成Block链的置换。

具有单点突变的RNA会产生错配，从而阻止置换反应的进行。研究人员通过对探针的设计来识别不同的目标RNA，并证明MARVE可以检测3种冠状病毒（SARS-CoV、中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和SARS-CoV-2）和7种流感亚型。此外，他们设计了一种折纸方案，用于该类检测的便携式部署。该折纸方案的反应步骤跨越多个纸层，通过简单地折叠纸以使反应中间体从一层流到下一层来顺序进行（上图b）。该折纸方案通过多个样本加载站点，可同时检测多种病毒，以及基于智能手机的图像处理。

单核苷酸突变检测

此外，李景虹教授及其团队采用MARVE技术来检测SARS-CoV-2变异毒株。他们实施了探针设计管道，并建立了用于检测 SARS-CoV-2的阵列反应，并在一张折纸中区分了SARS-CoV-2的4种不同变异毒株。这种仅用18天开发的多路复用MARVE检测方法，可在30分钟内提供肉眼或智能手机可见的检测结果。值得注意的是，它可以处理快速热裂解直接产生的RNA样本，无需靶标扩增或富集，从而减少了检测步骤和获得结果的时间。经临床咽拭子样本验证，该方法与通过RT-qPCR（逆转录聚合酶链式反应）和测序获得的结果完全一致。

总体而言，MARVE技术将核酸检测的特异性及检测时间和成本相结合，接近横向流动检测。这些特点的核心是Ag(I)/脲酶介导的检测方案。该方案只需要一个单一的酶和一个单一的DNA探针，避免了核酸扩增步骤，否则会增加检测的时间、成本和复杂性。MARV反应在室温下进行，无需加热块（热裂解步骤除外）。此外，MARVE检测的开发速度很快，因为只需要为每个有意义的目标RNA序列设计一个探针。相反，对于具有相似特异性的现有分析，通常必须开发扩增引物和探针。MARVE的简单性和准确性使其可用于家庭检测，并且可通过它快速确定已确认序列的变异的流行病学模式，作为下一代测序的补充。这种具有单核苷酸特异性的经济型且易于开发的诊断方法还可以为患者提供更个性化的治疗信息，并使测试能够更好地满足特定区域的特定需求，特别是在资源匮乏的环境中。

尽管折纸可以在4°C下使脲酶活性稳定约一个月，但在室温或更高温度下延长反应的保存时间将需提高测定的现场条件，无需昂贵的冷链配送和冷藏测试套件。每微升400拷贝的病毒RNA检测限优于横向流动检测的典型检测限，但它不足以检测所有活动性感染，也无法与RT-qPCR的灵敏度相匹配。可以简化MARVE以消除其对折纸折叠步骤的需要，以匹配横向流动分析的易用性。例如，可以将纸基微流控的控制方案与MARVE集成，以开发从RNA样本到多路复用结果的诊断，无需用户干预。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41551-022-00907-0#Fig1

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《新冠肺炎（COVID-19）诊断技术、厂商及趋势-2020版》

《RNA疫苗专利全景分析-2021版》